RNA 추출 가이드

Downstream application 에 바로 사용 가능한 고품질
RNA 추출 방법

질병, 건강, 생태계를 더 잘 이해하기 위해서는 qPCR, RNA-seq, northern botting, cDNA generation등의 핵심 분자생물학적 실험기법들이 사용되며, 이런 실험들을 진행하기 위해서는 생물학적 시료와 샘플로부터 RNA 추출이 필수적입니다.

RNA 실험을 위한 준비
RNA 추출을 위한 기본 실험 과정
RNA 추출 방법 별 특징
적합한 RNA 추출 방법 선택법
Guanidium-acid-phenol extraction 방법을 사용한 RNA isolation
RNA 정량 및 quality 측정
추출한 RNA의 보관

RNA 실험을 위한 준비

RNA 실험은 RNA 자체가 불안정한 성질을 가지고 있으며, 세포, 조직, 환경 등 어디에나 존재하는 ribonucleases에 의해 RNA가 빠르게 분해될 수 있어 다루기가 까다롭습니다. 이런 RNA의 degradation(분해)를 막기 위해서는 RNA 추출 실험을 진행할 때 아래의 실험 팁을 기억하시기 바랍니다.

Bench 와 pipettors을 70%에탄올과 3% 과산화수소로 깨끗하게 닦거나, RNase Erase와 같은 decontamination solution을 사용하세요.
피부에 있는 RNase로 부터 샘플을 보호하기 위해 실험장갑을 착용하세요
RNase-free 시약과 tube, tip을 사용하세요
실험 과정 중 특별히 상온에서 진행하거나 열을 가하는 과정을 제외하고는 전체 실험과정에서 샘플을 차게 유지하세요.
신속하게 실험 진행 - 시작하기 전 실험테이블 세팅, 용액과 장비 등을 미리 준비하세요

RNase Erase® decontamination solution, 500 mL

bench tops, 초자류 및 플라스틱 제품의 RNase를 완벽하게 제거하여, 소중한 RNA를 보호하세요.

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RNA 추출을 위한 기본 실험 과정

RNA 추출 방법에는 여러가지 다양한 방법들이 있지만, 공통적으로 basic step들을 포함하고 있습니다. 실험방법에 따라 실험과정 순서가 달라질 수 있습니다. (Table 1의 step 4-6)

Table 1 Basic Steps of RNA Extraction

순서	실험과정	세부사항
1	세포 및 조직의 수거	추출하고자 하는 샘플 (세포, 조직)의 수거 bacteria 세포의 경우, 원심분리 및 배지 제거 동물세포의 경우(monolayer), 배지 제거 및 PBS로 washing. Tissue의 경우, 타겟 조직을 적출
2	Cell lysis	Chaotropic agents (예, guanidine isothiocyanate)가 포함되어 있는 lysis buffer 또는 lysing matrices 와 같은 물리적인 파쇄 (혹은 두가지 조합)로 cell을 효율적으로 lysis 할 수 있습니다. lysis 방법의 선택은 샘플 타입에 따라 크게 달라집니다. bacteria cell의 경우 buffer로 쉽게 lysis 되지만, tough tissues는 더 강한 파쇄방법이 필요합니다.
3	RNases 불활성화	이 과정은 RNA를 보호에 매우 중요하며, phenol 과 chloroform과 같은 chaotropic agent에 의해 진행될 수 있습니다.
4	RNA Capture	RNA는 liquid-liquid extraction (예, phenol chloroform 추출)에서 특정 phase에 위치하거나 silica와 같은 solid surface로의 결합에 의해 분리될 수 있습니다. 만약 liquid-liquid extraction 방법을 사용한다면, RNA는 추출 후 침전시키고, 원심분리를 통해 수거될 수 있습니다. 100 % alcohol (예, isopropanol 또는 ethanol)이 핵산 침전과정에서 가장 일반적으로 사용됩니다.
5	DNA, proteins, 기타 세포 구성물질 제거	DNA는 RNase-free DNase로, proteins은 proteinase K 효소로 각각 제거할 수 있습니다. 프로토콜에 따라 처리 시기는 다를 수 있습니다. 또는 phenol과 chloroform을 이용한 organic extraction을 반복하거나 샘플을 protein을 제거하기 위해 guanidine salts가 포함되어 있는 buffer에 용해하는 방법도 있습니다.
6	RNA Resuspension 또는 elution	일반적으로, 분리된 RNA는 DEPC-treated water나 downstream application에 호환가능한 buffer에 resuspension 또는 elution 진행하게 됩니다.
7	RNA 정량 및 순도 측정	RNA 수율, 용액의 농도, RNA quality와 purity를 측정합니다. 일반적으로 UV spectroscopy를 이용하여 측정합니다.
8	RNA 보관	RNA integrity를 유지하고 분해를 막기위해, 장기보관시 분리된 RNA를 -80℃에 보관해야 합니다.

Lysing Matrices

MP Bio사의 bead beating tube와 최적화된 lysing matrix beads를 사용하여, 어떤 샘플에서건 재연성 있는 파쇄결과를 경험하세요.

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RNA 추출 방법 별 특징

아래 table 2에서와 같이 RNA를 추출하기 위한 다양한 방법들이 있으며, 가장 일반적으로 사용되는, 키트를 사용하지 않는 non-kit-based 방법은 guanidium-acid-phenol extraction 방법으로 일반적으로 Trizol 또는 TRIreagent 라고 부르기도 합니다. 그 외 guanidium-acid-phenol extraction 방법에 대한 우수한 시약과 상용화된 키트들이 다수 판매되고 있습니다.

Table 2 Common Methods of RNA Extraction

RNA 추출 방법	설명
Guanidium-acid-phenol extraction	원심분리를 이용한 liquid-liquid extraction 방법. RNA는 상부의 수층에 남게 되며, protein과 DNA는 하부의 phenol 층으로 분리됨. RNA는 alcohol을 이용한 침전 방식으로 분리
Silica technology, glass fiber filters	Solid-phase extraction 은 column-spin filter 방식으로 시판되는 kit에 주로 사용되고 있음. RNA는 silica에 결합하며 (dependent on chaotropic salts), 이후 wash 과정을 거쳐 elution 진행
Cesium chloride/cesium triflouroacetate density gradient centrifugation	CsCl gradient (농도구배) 형성을 위해 초고속 원심분리를 사용하는 liquid-liquid extraction 방법 RNA 층을 분리, 세척, resuspension 후 alcohol로 침전시켜 분리
Magnetic bead technology	RNA를 잡기 위해 silica와 같은 표면물질을 다양하게 한 초자성 (superparamagnetic) 20-30 nm particles particle을 잡고, 세척, elution step을 진행하기 위해 별도의 마그네틱 rack 이 사용됨.
Lithium chloride and urea isolation	조직은 urea-lithium에서 균질화를 통해 RNA를 침전. 그 후, RNA에서 protein을 분리하기 위해 phenol-chloroform solution이 사용 RNA를 침전시키기 위해 ethanol 사용
Lithium chloride (LiCl) precipitation	침전을 위해 alcohol 대신 LiCl을 사용 - DNA에 비해 RNA를 우선적으로 침전시키기 때문에 RNA 추출에 유리할 수 있음.
Oligo(dt)-cellulose column	oligo(dt) cellulose resin을 이용하여 상보적인 염기 결합에 의해 RNA를 잡는 방식으로, mRNA나 poly(A) tail을 가진 synthetic RNA 추출에 유용한 컬럼 크로마토그래피 추출법

RNA-PLUS™ (phenol solution), 100 mL

RNA를 single step으로 추출할 수 있는 제품으로, DNA와 protein은 효율적으로 제거되고 추출된 RNA는 degradation 없이 고유의 특성을 유지합니다.

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적합한 RNA 추출 방법 선택법

올바른 RNA 추출 방법을 선택하면 시간과 샘플을 절약할 수 있지만, 사용할 수 있는 방법과 kit가 너무 다양하기 때문에, 최적의 방법을 선택하기에 어려움이 있을 수 있습니다.

아래 질문들이 최적의 RNA 추출방법 선택에 도움을 드릴 수 있습니다.

샘플 type 이 무엇이며, lysis 하기 얼마나 어렵습니까?
어떤 type의 RNA를 분리해야 합니까? (예, miRNA, tRNA, total RNA 등)
Downstream application에 어느정도 양의 RNA가 필요합니까?
얼마나 많은 샘플을 처리해야 합니까? high-throughput 방법을 고려하고 있습니까?
특정 suspension solution이 downstream application을 저해합니까?
샘플에서 다른 molecules도 분리해야 합니까? (예, protein, DNA)

MP Bio사의 kit (Table 3)를 사용하시면 어떤 샘플에서건 고품질의 ready-to-use RNA를 추출할 수 있습니다. 일부 kit는 high-throughput 처리가 가능하며, 하나의 샘플에서 protein 과 RNA를 추출할 수 있도록 프로토콜을 조정할 수 있는 제품도 있습니다.

Table 3: MP Bio RNA Isolation Kits

Kit	샘플 타입	설명	레퍼런스
FastRNA Pro Soil-Direct	Soil/Environmental	토양이나 토양 상층액으로 부터 total RNA 추출. 이 kit는 humic substances 와 다른 inhibitors들을 제거하며, RNA degradation을 막기 위해 homogenization 과정동안 세포내의 RNase를 효율적으로 불활성화 시킴.	Read
FastRNA Pro Soil-Indirect	Soil/Environmental Supernatants		Read
FastRNA ProBlue	Gram +/- Bacteria	온전한 total RNA가 RNAPro™ solution으로 안전하게 release 됨. RNApro™ solution은 cell lysis 동안 RNA degradation을 막기 위해 세포내의 RNase를 불활성화 시킴. RNA는 chloroform 추출, ethanol 침전을 거쳐 분리. total RNA resuspension을 위해 DEPC-treated water 제공	Read
FastRNA ProRed	Yeast, Fungi		Read
FastRNA Pro Green	Plants, Animals tissue, Cultured Cells		Read
FastRNA™ SPIN Kit for Microbes	Tough-to-lyse Bacterial Cell Cultures	약 15분 내 total RNA 분리	Read
FastRNA™ SPIN Kit for Yeast	Tough-to-lyse Yeast Strains, Fungi and Algae	약 15분 내 total RNA 분리	Read
RapidPure RNA Plant Kit	Plant Cells, Plant Tissues and Filamentous Fungi	spin filter column을 이용하여 total RNA 분리. FastRNA systems과 달리 이 kit는 cell을 파쇄하기 위해 lysing Matrix 를 사용하지 않음. 대체품으로 FastRNA Pro Green Kit 사용 가능
RapidPure RNA Tissue Kit	Human and Animal Tissues	다양한 사람과 동물의 소량의 tissue로 부터 고품질의 total RNA 분리 및 정제. total RNA와 protein을 동시에 추출. FastRNA system과 달리 이 kit는 cell을 lysis 시키기 위해 lysing matrix를 사용하지 않음. 대체품으로 FastRNA Pro Green kit를 사용 가능.
MPure Viral RNA Extraction Kit	Human Biological Specimens	Magnetic bead solution을 사용하여 viral RNA 추출
MPure Total RNA Extraction Kit	Whole Blood, Blood Cells, Animal Tissue, Plant Tissue, Yeast or Cultured Cells	Magnetic bead solution을 사용하여 total RNA 추출	Read

Guanidium-acid-phenol extraction 방법을 사용한 RNA isolation

이 방법은 가장 일반적인 liquid-liquid extraction 방법으로, silica-based column방법보다 오래 걸리지만, RNA 회수율이 높은 경우가 많습니다. 수용성 샘플을 phenol & chloroform solution과 혼합하여 원심분리를 통한 층 분리로 진행됩니다. 원심분리 후에는 위쪽에는 수층, 아래쪽에는 phenol 층이 명확하게 형성되며, 상층에 target RNA가 포함되게 됩니다.

Guanidium thiocyanate는 chaotropic agent로 이것은 Trizol의 구성품이며, protein을 denaturing 하는데 중요한 역할을 합니다. (Protein 이 남아 있는 경우 핵산에 결합하거나, RNA를 degradation 시켜 효율을 떨어뜨릴 수 있습니다.)

pH는 아주 중요합니다. 4 정도의 낮은 pH는 RNA만 수층에 남게 하며, DNA와 protein은 organic phenol layer에 남게 합니다. 이는 DNA 추출과는 다른데, DNA 추출의 경우 pH 6 또는 7의 guanidium thiocyanate-phenol solution을 사용하게 되며, DNA와 RNA는 수층으로 분리되게 됩니다.

RNA를 침전시키기 위해 수층 (aqueous phase)를 새 tube로 옮긴 후 isopropyl alcohol을 첨가하게 됩니다. Alcohol은 RNA의 negative phosphate backbone을 중화시키는 hydration shell에 영향을 줍니다. 물 분자 대신 양전하를 띄고 있는 metal salt ion으로 음전하를 띄고 있는 RNA를 중화시키고, 중성을 띄게 된 RNA는 수층에서 응집하게 되며, 원심분리를 통해 pellet으로 분리하게 됩니다. 70% ethanol washing 과정을 통해 salts를 제거하고 DEPC (Diethylpyrocarbonate) 가 처리된 water를 이용하여, RNA pellet을 녹이면 됩니다.

왜 DEPC water 를 사용해야 할까요? DEPC는 RNase 효소내 amine, hydroxy, 그리고 thiol group과 반응하여 비특이적으로 RNase를 저해하여 안전하게 RNA를 보관할 수 있습니다.

RNAPro Solution, 2 x 27.5 mL

Plant, animal tissue, cultured cells, microbes, 또는 토양 및 환경 샘플 등 다양한 샘플로 부터 total RNA를 효율적으로 분리할 수 있습니다. Recent publication

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Bacteria cell에서 RNA를 추출하는 일반적인 방법

밤샘 배양한 bacteria cell을 원심분리 (12,000xg , 2분)을 통해 pellet 형성
Luria broth 상층액 제거
pellet을 RNA-PLUS™ (comparable to TRIzol) 에 다시 풀어주고, 여러차례 pipetting을 통해 lysis 시킴 (종종 pellet이 tube 바닥에 남아 수율이 낮아질 수 있으므로, pellet이 완전히 풀어졌는지 확인 )
원심분리 (4°C at 12,000xg, 10분)
상층액을 새 tube로 옮김 (tube를 뒤집지 말 것)
chloroform 첨가 후 강력하게 share 또는 vortex, 실온에서 3분간 배양
원심분리 (12,000xg, 15min) 후 위쪽의 투명한 층 (RNA 포함되어 있음)과 아래쪽의 붉은색을 띄는 phenol 층 (contaminating proteins 포함되어 있음)으로 나뉜 것을 확인 가능
위쪽의 수층을 깨끗한 RNase-free tube로 옮김 (phenol 층은 옮기지 않도록 주의)/span>
100% isopropyl alcohol 첨가 후 실온에서 10분간 반응하여 RNA 침전
원심분리 (4°C, 12,000g, 10분)
상층액을 버림
pellet을 70-80% ethanol 로 wash (tube를 여러차례 inverting)
원심분리 (4°C, 7500xg, 5분)
에탄올 버림
pellet을 실온에서 대략 10분간 air dry
pellet을 DEPC-treated water (또는 적절한 버퍼사용)에 풀어 줌

RNA 정량 및 quality 측정

RNA를 사용하기 전에, RNA의 수율과 순도를 알아야 합니다. 가장 일반적인 방법은 UV spectroscopy를 사용하여 RNA를 정량하는 것입니다.

수율 (Quantity): A₂₆₀ of 1.0 이 대략 40 µg/mL single-stranded RNA (pH는 대략 7.5)에 해당

순도 (Quality): A₂₆₀/A₂₈₀이 1.8-2.1사이이면 고순도의 RNA임을 의미

이 방법의 경우 RNA와 DNA를 구분하지 못하기 때문에 RNase-free DNase로 처리하여 DNA를 제거하는 것도 고려해 보셔야 합니다.

추출한 RNA의 보관

RNA를 성공적으로 추출한 경우, 다음 실험에 사용하기 위하 안전하게 보관하는 것이 중요합니다.
안전하게 보관하기 위해서는 반복된 freeze-thaw cycles로 RNA가 손상되는 것을 막고, RNase 오염을 막기 위해 1회 사용할 수 있는 양 정도씩 분주하여 -80°C에 보관하는 것을 권장합니다.