Tips for RNA Extraction Troubleshooting

Low yield

Spin column에서 불완전한 elution

• Elution 과정에서, nuclease-free water 를 column matrix에 첨가 후 원심분리 전 실온에서 5-10분간 방치하시기 바랍니다.

• RNA 수율을 최대로 높이기 위해서는 가능한 많은 양의 Elution buffer를 사용하십시오. RNA 농축이 필요한 경우 ethanol 침전을 사용하여 언제든 농축할 수 있습니다.

부적절한 보관 또는 과도한 homogenization 조건으로 인해 열 발생 혹은 shearing으로 RNA 샘플이 손상

• 가능하면 샘플 채취 직후 샘플을 -80°C에 보관하십시오.

• 과열을 방지하기 위해 homogenization 진행 시 30-45초간 파쇄 후 30 초간의 rest time을 가지십시오.

• 만약 fresh tissue를 사용한다면 RNase activity를 막기위해 조직 채취 후 바로 cold guanidine lysis buffer 를 첨가하세요.

샘플 파쇄 단계에서 불충분하게 파쇄가 진행된 경우

• 효율적인 샘플 파쇄를 위해서 다른 종류의 lysing matrix 를 사용하거나 cryo-conditions으로 파쇄를 진행하십시오.

• Sample digestion이나 homogenization 시간을 늘려주십시오.

• Proteinase K digestion 또는 homogenization 후 debris를 침전 시키기 위해 원심분리 진행하고, RNA가 포함되어 있는 상층액을 새 tube로 옮기세요.

• RNA의 yield를 높이기 위해 Proteinase K (from 5% to 10%)의 양을 두배로 늘려주십시오.

샘플이 너무 많은 경우

• 초기 시작하는 샘플량을 kit 프로토콜에서 제안하는 범위내로 줄여주십시오.

• 매번 동일한 샘플량을 사용하거나 yield를 예측할 수 있도록 하기 위해 저울에 정량하여 사용하십시오. cells에서 RNA를 추출한다면 RNA추출 전 cell 수를 counting 하는것을 고려하십시오.

RNA밴드가 전기영동상에서 smear로 관찰

샘플 (starting material)의 부적절한 보관

• 샘플 수집 후 즉시 액체질소 혹은 -80°C에 얼려 보관하십시오.

추출과정에서 샘플이 제대로 취급되지 않음

• beta-mercaptoethanol (2-ME)을 lysis buffer (10 µl of 14.3M BME per 1 ml of lysis buffer)에 첨가하여 추출과정동안 RNases를 불활성화 시키고 샘플을 안정화시키십시오.

추출한 RNA 또는 키트내 buffer가 RNase에 오염된 경우

• RNase 제거 용액인 RNase Erase를 사용하여, 실험대를 깨끗하게 청소하고, RNA 취급을 위한 실험실 영역을 지정하는 것을 고려하십시오.

• RNA 실험을 진행하는 동안은 지속적으로 실험 glove를 착용하고, 한 실험 프로토콜 에서도 필요시 주기적으로 장갑을 교체하기도 합니다.

• 여러 용액 사용시 pipette tip을 교체하고 buffer 도 fresh하게 만들어 사용하십시오.

전기영동 장치 또는 피펫 등이 RNase에 오염된 경우

• Tip, microcentrifuge tubes 및 그 외 소모품들을 0.1% DEPC 처리 후 autoclave 진행하십시오.

• 모든 표면, pipettes, 전기영동 카세트 및 탱크, 그 외 RNA 실험에 사용되는 소모품 및 장치들을 RNase Erase decontamination solution으로 깨끗하게 닦아주십시오.

• 시중에 판매하는 50X TAE (직접제조한 버퍼보다는)를 사용하고, DEPC water로 희석하여 가능한한 빨리 RNA 전기영동을 수행하십시오.

DNA 오염

컬럼에 의해 genomic DNA가 제대로 제거되지 않음

• gDNA를 제거할 수 있는 가장 좋은 방법은 DNase를 처리하는 것입니다. Column 내에서 혹은 tube 상에서 샘플에 DNase를 처리하는 것을 고려하십시오.

샘플양을 너무 많이 사용한 경우

• 제품 설명서를 참고하여, buffer가 넘치는 것을 방지하기 위해 (필요시) 초기 시작하는 샘플양을 조절하십시오.

Homogenization 과정에서 DNA 가 불충분하게 절단 (insufficiently sheared)

• 적절한 lysing matrix를 사용하여 bead beating 하는 방식 등 DNA를 절단시킬 수 있는 적절한 파쇄방법을 사용하십시오.

• Bead beating를 이용한 물리적인 파쇄는 샘플에 열이 가해질 수 있지만, guanidine 상에서 샘플을 냉각하는 것은 salt를 침전시킬 수 있기 때문에 homogenization과 cool down 사이의 최적의 시간조건을 찾아야 합니다.

Phenol 방법 사용시, pH 가 적합하지 않아 (too basic), nucleic acid segregation이 진행되지 않음

• pH가 acidic을 유지하기 위해 시약과 버퍼를 다시 만들거나 pH 테스트가 필요합니다.

컬럼 막힘 현상

샘플이 충분하게 파쇄되지 않음

• 샘플 digestion이나 homogenization 시간을 늘려주거나 좀더 강한 lysing matrix를 사용해 보십시오.

• Proteinase K digestion 또는 homogenization 후 debris를 가라앉히기 위해 원심분리를 진행하고, 이후 실험 과정을 진행하기 위해 상층액을 새 tube로 옮기십시오.

• 파쇄가 어려운 샘플의 경우 metal lysing tube를 사용하거나 cryogenic condition에서 파쇄하는 것을 고려하십시오.

컬럼에 너무 많은 샘플을 넣음

• 키트내 프로토콜에서 권장사항을 참고하여, 초기 시작하는 샘플 양을 줄이십시오.

비정상적인 흡광도 측정값

RNA농도가 너무 낮음

• 더 농축된 RNA를 얻기 위해서는 더 적은 양의 nuclease-free water를 사용하여 elution을 진행하십시오.

• 더 많은 양의 샘플을 사용하여 실험을 진행하십시오 (키트 내 프로토콜 참조)

Silica particles이 같이 용출됨

• elution된 샘플을 한 번 더 원심분리하여 silica particles을 tube 바닥으로 가라앉히십시오. silica pellet을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 따서 A260/230을 다시 측정하시기 바랍니다.

낮은 OD 비율

낮은 A260/280 value: 추출한 RNA에 protein 이 오염되었음을 의미하며, 일반적으로 샘플량이 너무 많았을 때 생길 수 있음

• Proteinase K step 이 적절한 시간동안 잘 진행되었는지 확인하십시오.

• 샘플을 정제 컬럼에 로딩하기전 debris가 없는지 잘 확인하십시오

• 다른 clean-up 방법을 사용하여, 샘플을 한 번 더 정제하고, 다음 진행시 더 적은 양의 샘플을 사용할 것을 고려하십시오.

낮은 A260/230 value: 정제된 RNA에 guanidine salts나 humic acids와 같은 organic inhibitors 가 존재함

• 70-80% 에탄올 wash step을 silica prep 프로토콜에 추가하거나 precipitation 프로토콜에서 ethanol을 사용하여 pellet wash 과정을 진행하십시오

• 새 컬럼에서 샘플을 한 번 더 정제하고, elution 전 wash를 충분히 진행하는 것을 고려해 보십시오.

Downstream 실험에서 RNA의 낮은 성능

Elution 과정에서 Salt 또는 ethanol이 같이 carry over 됨

• 최종 wash 진행 후 spin column의 끝이 elution 용액과 접촉하지 않도록 하십시오. 만약 이런 상황이 발생한 경우 원심분리를 다시한번 진행하시기 바랍니다.

• 만약 collection tubes를 다시 사용하는 경우, column에 다시 장착하기 전에 tube 가장자리를 Kimwipe에 찍어 잔여 wash buffer를 제거하십시오.

• Elution 전 추가적인 wash step을 진행하십시오.