메타지노믹 샘플 준비의 챌린지

고품질의 metagenomic DNA를 얻기 위해서는 강력하고 재현성이 높은 샘플준비 절차가 필요합니다. 하지만 메타지노믹스를 연구하는 연구자들은 종종 최적의 실험방법을 찾는데 어려움을 겪고 있으며, 샘플 수집부터 DNA 추출, library 준비에 이르기까지 모든 단계에서 챌린지들을 겪게 됩니다.

Metagenomic DNA를 준비하기 위한 workflow를 설계할 때 고려해야 할 사항은 아래와 같습니다:

1. 연구에 대한 질문
2. 미생물 군집 구성에 대한 연구자의 이해 (예, 어떤 미생물이 존재하는지에 대해 알고 계십니까?)
3. 미생물 군집의 사이트간 (site-to-site)이질성 과 이것이 샘플링 방법에 미치는 영향
4. 작업 중인 서식지와 마이크로바이옴이 다양한 노출에 어떻게 영향을 받는지
5. 시퀀싱 접근 방식 및 플랫폼

이러한 요인을 이해하면 적절한 샘플링, 균질화(homogenization), DNA 추출 및 library 준비 방법을 선택하는데 도움이 됩니다. 이번 편에서는 메타지노믹 연구에서의 몇 가지 주요한 챌린지들과 개별 연구 및 전체 분야에 미치는 영향, 위의 요소들이 이런 챌린지들을 해결하는데 어떻게 도움이 되는지에 대해 설명 드리겠습니다.

Metagenomic DNA 연구를 위한 샘플 확보

챌린지:

미생물 군집은 샘플 유형 (토양, 분변, 장 내용물 등)에 관계없이 위치와 외부 요인에 따라 달라질 수 있는 수백에서 수천개의 서로 다른 박테리아와 바이러스로 구성되어 있어 아주 복잡합니다. 예를 들어, 식물의 마이크로바이옴은 잎과 줄기 (Beckers et al) 에 따라 다양하며, 사람의 장 마이크로바이옴은 식단에 따라 극적으로 변화합니다(David et al ). 따라서 Sample preparation 과정 전반에 걸쳐, 대표 표본을 수집하고, 대표성을 보존하는 것은 어려운 일입니다.

다음과 같은 부분들을 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 잘 확인하셔야 합니다.

• Sample Collection 관련:
  • 샘플 수집 장소가 어떤 미생물이 존재하는지에 영향을 미칩니다.
  • 샘플 사이즈가 해당 위치에서 어떤 미생물들을 성공적으로 캡처해내는지에 영향을 미칩니다.
  • 각 영역에서 채취한 샘플의 수가 충분하지 않을 경우 metagenomic 샘플, 즉 metagenomic DNA가 대상 생태계의 특정 위치로 제한됩니다.
  • 관심있는 군집의 구성에 영향을 미치는 주요 요인들을 제대로 이해하지 못하면, 연구 설계가 잘못되어 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다.
• DNA 추출관련:
  • 왜곡되거나 부적절한 DNA 추출 방법. 일부 DNA 추출 방법의 경우 미생물 군집내의 특정 집단에 너무 강하거나 약하게 작용하여 DNA가 제대로 추출되지 않거나 분해되는 경우가 있습니다.
  • 오염이나 host DNA가 너무 많은 경우 희귀 종 (rare species)을 발견하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다.

실험에 미치는 영향:

샘플링(표본 추출)이나 DNA 추출방법이 부적절하여 미생물 군집이 잘못 표현되면, 미생물 군집 구조와 군집 비중에 있어 왜곡된 그림이 그려지고, 이로 인해 데이터 오류 발생 및 여러 연구결과를 비교하는 것이 어려워집니다. 특정 미생물 군집 구성원이 검출되지 않거나 또는 과하게 표현되어 과학자들이 미생물 생태계의 진정한 군집구조를 잘못 평가하게 됩니다. 이로 인해, 특히 개별 연구나 연구소의 경우, 시간과 자원을 낭비하는 잘못된 방향으로 연구방향을 진행하게 되거나 왜곡된 결론을 도출할 수도 있습니다. 또한 이러한 결과는 학계에서 실제 데이터로 받아져 왜곡된 data pool이 구축되거나 최적화되지 않은 연구를 설계하게 될 수도 있습니다.

또는, 목표로 하는 미생물이 발견되지 않아, 어떤 프로젝트를 조기에 포기하는 경우도 있는데, 목표미생물이 존재하지 않는 것은 사실일 수 있지만, 이는 희귀하거나 알려지지 않은 종을 간과하는 샘플링 또는 추출 문제로 인한 잘못된 결과일 수도 있습니다.

샘플 타입과 연구목적 (예: 농약이 미생물 구성에 어떤 영향을 미치는지 vs토양 미생물 조성이 옥수수 성장에 어떤 영향을 미치는지 등)을 바탕으로 샘플링 및 메타지노믹 DNA 추출방법을 선택하고, 각 연구 내에서 실험방법들을 비교하여 최적화된 방법을 구축해야 합니다.

이 문제를 접근하는 방법:

• 샘플의 환경적으로 구별되는 영역을 식별하고 샘플링 방법을 설계할 때 각 영역이 잘 대표되는지를 확인하십시오.
• 서식지 내의 다양한 위치에서 샘플링을 진행하고, 각 샘플 간의 미생물 변동성 수준을 평가합니다.
• 다양한 방법과 DNA 추출 키트들을 비교하여, 실험방법을 최적화합니다.
• Control primer를 사용하여 이미 알려져 있는 종의 존재여부와 비중을 검출합니다.

고순도 DNA를 충분한 양으로 추출

챌린지:

메타지노믹스 연구의 제한요소는 종종 DNA의 품질과 양입니다. 생태계를 대표하는 DNA를 분리하고 싶지만 충분하지 않거나 host DNA, RNA, protein 또는 기타 물질들로 오염된 경우 library 준비 및 시퀀싱 단계가 실패할 수도 있습니다. 이것은 metagenomic 샘플의 복잡성과 다양성으로 인해 야기되는 문제들입니다.

연구자들이 어려워하지만, 중요한 질문들은 다음과 같습니다:

• 샘플을 전처리 해야합니까? 그렇다면 어떻게 그리고, 대표성 (representation)은 잘 보존될 수 있습니까?
• 어떤 DNA 추출 방법을 사용해야 합니까? 기존 방법이 있습니까? 아니면 특정 샘플에 맞게 일부과정을 수정해야 합니까?
• 샘플이 순도가 높고 대표성을 가지고 있다는 것을 어떻게 확신할 수 있습니까?
• 희귀하거나(rare) 알려지지 않은 미생물의 검출을 최대화하려면 어떻게 해야 합니까?

실험에 미치는 영향:

샘플 유형과 연구 질문이 연구마다 다르기 때문에 연구실 또는 현장 모두에서 공통적으로 유용한 방법을 표준화 하는 것은 매우 어려우며, 이는 연구자들이 비효율적이거나 편향된 방법으로 실험을 진행하게 될 수도 있습니다.

시퀀싱 기술은 오염물질에 매우 민감하며, 사용하는 시퀀싱 플랫폼에 따라 필요로 하는 DNA 양도 달라질 수 있습니다. DNA 샘플이 특정 library 준비 또는 사용하는 시퀀싱 테크놀로지에서 요구하는 양과 품질을 충족시키지 못하면 해석이 불가능한 지저분한 데이터를 얻게 되고, 이는 프로젝트가 어디에서 잘못되었는지 문제를 파악하고 향후 이런 문제를 완화시키기 위한 방법을 파악해야 하는 과정을 추가로 필요로 합니다.

최적화된 방법을 사용하면 troubleshooting에 소모되는 시간을 없애고, 높은 처리량의 자동화 시스템을 채택하여 워크플로우를 간소화할 수 있는 기회를 얻으실 수 있습니다.

이 문제를 접근하는 방법:

• 샘플은 효율적으로 파쇄하고 오염물질과 host DNA는 제거하기 위해 lysis buffer와 bead beating과 같은 물리적인 힘을 조합하여 사용합니다.
• DNA추출 방식과 DNA extraction kit들을 비교하여 DNA 추출방법을 최적화합니다.
• Gel 전기영동 또는 spectrophotometer를 사용하여 DNA의 양과 순도를 측정합니다.
• 샘플 타입에 따라 적합한 lysing matrix 선택방법과 다양한 비드 재질과 크기가 어떤 기능을 하는지를 알아보십시오.

Library 준비를 위한 metagenomic sample의 DNA shearing 최적화

챌린지:

DNA shearing은 next generation sequencing에서 필수적인 단계이며, 따라서 최적의 shearing 방법은 신뢰할 수 있는 sequencing 결과를 생성하는데 도움이 됩니다. DNA를 효율적으로 fragmentation 시키기 위해 acoustic cavitation, enzymatic 또는 mechanical methods를 이용한 방법 등 다양한 방법이 사용됩니다.

여기에서의 챌린지는 다음과 같은 방법을 찾아내고 최적화하는 것입니다:

• 적절하고 일관된 크기의 DNA 조각 생성
• fragmentation이 무작위적이고 sequence-independent하게, 편향되지 않은 shearing 을 수행
• 샘플간의 교차오염 없이 pure DNA 샘플 획득
• 높은 DNA 수율을 유지하기 위해 샘플 손실을 최소화

실험에 미치는 영향:

실험에 미치는 영향을 이해하려면 DNA shearing 의 다운스트림 워크플로우를 이해하는 것이 중요합니다. Shearing 이후, DNA fragments는 크기에 따라 선택되고, 시퀀싱을 위해 준비(예, tagging), 염기서열 분석, reference genome 에 mapping 됩니다. Sequence-specific DNA shearing은 fragment 크기의 균일성이 결여될 수 있습니다. 크기를 선택하는 동안, 연구자들은 원하지 않는 length를 제거하는데, 그 결과 중요한 DNA 영역이 제거되고 미생물 구성원이 과소 표시될 수 있습니다.

또한, 특정 염기서열에 편향된 DNA shearing은 fragment overlap에 영향을 미칠 수 있습니다. 만약 샘플에서 미생물 구성원간에 공통적으로 존재하는 genomic region을 모니터링 하는 경우, fragments는 종 마다 구별되지 않을 수 있으며, "mismapping" 또는 copy number variation에 있어 부정확한 평가를 유발할 수 있습니다. 이로 인해 연구자들은 특정 미생물 구성원들이 없거나 지나치게 많이 존재하는 것으로 간주하여 미생물 분포에 대한 왜곡된 그림을 그리게 될 수 있습니다.

Non-random DNA fragmentation은 현재 다양한 genomic region에서 non-uniform coverage의 원인으로 분석되고 있습니다. Sonication과 hydrodynamic shearing의 sequence-specificity 와 이런 편향을 이해하는 것이 실험 설계 및 mapping에 어떻게 도움이 되는지가 초점입니다(Poptsova et al.).

신뢰할 수 있는 sequencing 결과를 생성하려면, DNA shearing 방법이 sequence-independent 해야 하며, 그렇지 않으면 이렇게 편향된 데이터에 대한 수정 옵션을 찾아야 합니다.

이 문제를 접근하는 방법:

• 특정 application에 대한 검증된 접근방식을 사용합니다. (예, FastPrep-96은 high-throughput 조건에서 100-1000ng의 genomic DNA (gDNA)를 10-14kb의 길이를 생성하는데 대해 검증되었습니다. 자세히 보기
• 샘플에서 실험 방법들 (예, acoustic cavitation vs. enzymatic shearing vs. mechanical shearing) 을 비교해보세요.
• Metagenomic 샘플의 degradation을 방지하기 위해 샘플을 차게 보관하십시오.
• shearing 속도/강도, shearing 시간, 사이클 수 등을 최적화하세요.

메타지노믹 샘플 준비의 난제를 해결하는 연구 사례