비드 비팅 테크놀로지

Lysing matrix 는 샘플을 물리적으로 파쇄하고, 균질화 시키기 위해 사용하는 비드(bead) 입니다. Lysing matrix는 크기, 모양, 재질 및 구성에 따라 다양하며, 적절한 비드를 선택하기 위해서는 샘플의 유형, 원하는 입자의 크기, target molecule의 안정성 (또는 분해 취약성)등을 고려해야 합니다.

Lysate에서 얻고자 하는 입자(particle)의 크기에 따라 matrix 비드의 사이즈를 선택해야 합니다. Lysing matrix에 사용된 비드가 작을수록 파쇄에 의해 생긴 입자(particle)의 평균 사이즈도 작아집니다. 비드의 크기는 마이크론 (micron)에서 센티미터 (centimeter)까지 다양하며, 범위는 비드의 재질에 따라 달라질 수 있습니다. 경우에 따라, 원하는 파쇄결과를 얻기 위해서는 다양한 크기의 비드들이 필요할 수도 있습니다.

비드의 모양은 세포가 어떻게 파쇄되는지를 결정하며, lysis와 homogenization 과정이 얼마나 강한지에 영향을 미칩니다. lysing bead는 구형(spherical: 충격(impaction)>과 해머링(hammering)을 주요 힘으로 사용)과 각진형(angular: 샘플을 절단하기 위한 물리적인 shear force 발생)으로 분류될 수 있습니다.

Lysing bead의 모양은 샘플 타입과 용도에 따라 선택해야 합니다. satellites와 같은 각이진 형태의 matrix는 날카로우며, 파쇄가 까다로운 cell wall과 섬유조직 (fibrous tissue)과 같은 샘플을 빠르게 lysis 하고 파쇄할 수 있습니다. 이런 shear force는 DNA와 small molecule 같은 안정적인 molecule을 분리하는데 이상적이지만, RNA나 특정 단백질과 같은 불안정한 molecule이나 세포 기관을 분리하는 데는 구형의 matrix가 더 적합합니다.

샘플 파쇄를 위해서 여러 가지 다른 재질의 비드를 사용할 수 있으며, 각 재질은 장단점이 있습니다. lysing bead의 재질은 밀도(density), 경도(hardness), 내구성(durability)과 내화학성(chemical resistance)을 결정하며, 이것은 lysis 효율과 target analyte의 integrity에 영향을 미칩니다. lysing bead의 경도(hardness)는 반드시 샘플보다 커야 하며, 높은 경도는 딱딱하고 부서지기 쉬운 세포막을 분쇄하는데 더 효과적입니다. 일부 샘플들의 경우 개별 비드 타입만으로도 샘플을 파쇄하기에는 충분하기만, 더 까다로운 샘플의 경우 비드 재질을 조합하여 파쇄할 경우 더 효율적일 수 있습니다.

• Silica – 이 재질은 밀도가 가장 낮고 단단하지 않으며, 일반적으로 구형이면서 다른 비드 재료에 비해 크기가 작기 때문에 덜 공격적입니다. Silica는 주로 미생물을 파쇄하는 데 사용됩니다.
• Ceramic – 실리카보다 밀도와 강도가 높고 화학적으로 불활성화 상태여서 핵산에 결합하지 않습니다. 부드러운 동물 조직, 식물 조직, 곤충 전체에 적합합니다.
• Silicon Carbide – 상대적으로 밀도가 낮고 강도와 경도가 높아 거칠거나 단단하거나 부서지기 쉬운 세포막을 파쇄하는 데 유용합니다. 이 재질은 높은 충격과 낮은 전단력(shearing)을 가지기 때문에 온전한 세포 소기관, 초분자 구조, RNA 및 단백질을 분리하는 데 적합합니다.
• Glass – 내구성과 밀도가 낮은 소재이지만 가격이 저렴하여 널리 사용됩니다. 불활성화 상태이지만 Silane을 사용하여 변형하거나 유도체화 할 수 있습니다. Glass beads는 전단 강도(shearing intensity)를 줄이기 위해 다른 beads 재료와 함께 사용할 수 있습니다.
• Zirconium Silicate – glass보다 밀도가 높지만 stainless steel 및 zirconium oxide 보다는 낮습니다. Silane을 사용하여 부분적으로 변형하거나 유도체화 할 수 있습니다.
• Zirconium Oxide – 밀도, 내구성 및 경도가 높은 소재입니다. 밀도가 높은 외부 매트릭스가 있는 유기체를 포함하여 매우 거칠고 단단한 샘플을 파쇄할 수 있습니다. 경도, 밀도 및 내구성을 증가시키기 위해 zirconium oxide beads는 이트리아 안정화 (yttria-stabilized) 또는 세리아 안정화(ceria-stabilized)될 수 있습니다.
• Stainless Steel – 모든 재료 유형 중에서 가장 단단하고 밀도가 높기 때문에 최소한의 전단력으로 높은 충격을 생성합니다. Stainless steel beads와 balls은 파쇄가 까다로운 샘플에서 RNA 추출에 적합합니다. 단점은 페놀 및 산과 반응할 수 있으며, 이것은 sample process 과정에 방해가 될 수 있습니다.
• Garnet – Garnet matrix는 매우 공격적이어서 DNA 분리에는 매우 효과적이지만 RNA 및 단백질 분리 응용 분야에는 잠재적으로 너무 강한 조건일 수 있습니다. 화학적으로 불활성 상태여서 핵산에 결합하지 않습니다. Zirconium과 함께 사용하면 거의 모든 샘플을 용해할 수 있습니다.

파쇄 비드의 크기, 모양 및 재질의 조합은 단일 샘플 내에서 세포 파쇄를 최적화하는 데 도움이 됩니다. 시중에는 바로 사용할 수 있는 고품질의 파쇄용 비드 제품들이 상용화 되어 있습니다. 예를 들어, MP Bio는 교차 오염은 방지하고, 모든 샘플 유형 및 응용 분야에서 가장 높은 수율로 핵산 및 단백질을 신속하게 추출하도록 최적화된 lysing beads and matrices 와 Biopulverizer^TM Lysing Matrix Set을 제공하고 있습니다.

Bead Beating Lysing Matrix 성능

비드 크기, 모양, 재질 및 구성에 따라 달라지는 lysing matrix의 강도(aggressiveness)의 관점에서 bead beating 성능에 대해 말하고자 합니다. 일반적으로 작은 구형의 비드는 큰 각진 비드 보다 덜 공격적입니다. 저밀도 및 "softer" 비드는 고밀도의 더 단단한 비드 보다 덜 공격적입니다. 샘플을 효과적으로 lysis 하고 homogenize 할 matrix를 선택할 때 각 lysing beads의 특성의 영향을 이해하는 것이 중요합니다. Matrix의 구성이 더 복잡할 수 록 성능을 이해하기가 어려워집니다. 다음은 몇 가지 일반적인 가이드입니다:

• 가장 덜 공격적인 매트릭스는 작고 밀도가 낮고 덜 단단한 구체입니다. 이로 인해 중간 정도의 충격이 있는 낮은 전단력이 발생하며 세포벽이 부드럽고 세포 크기가 작은 샘플에 가장 적합합니다.

• 가장 공격적인 매트릭스는 크고 각진 고밀도 비드입니다. 이로 인해 높은 충격과 함께 높은 전단력이 발생하며 탄성 세포벽과 중간 크기에서 큰 세포 크기가 있는 조밀한 샘플에 가장 적합합니다.

• 중간 정도의 공격적인 매트릭스는 낮거나 높은 공격적인 매트릭스 특성을 결합하여 생성되며 세포벽이 부서지기 쉽고 세포의 크기가 작거나 큰 단단한 샘플에 적합합니다. 밀도와 경도가 낮은 크고 각진 용해 매트릭스는 중간에서 높은 충격으로 중간 전단력을 생성합니다. 또는 고밀도의 단단한 구체와 같은 작은 매트릭스는 낮은 전단력과 높은 충격을 유발합니다.

샘플 타입과 application에 따른 Bead Beating Technology의 선택

샘플에 따라 밀도, 경도 및 세포 크기가 다양하기 때문에, 샘플에 따라 다른 lysing beads 및 homogenization 방식이 필요합니다. 예를 들어, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아는 낮은 전단, 중간 충격을 생성하는 matrix로 충분히 용해되는 반면, 뼈 샘플은 높은 전단, 높은 충격을 갖는 matrix가 필요합니다. 또한 특정 application 또는 분리하고자 하는 target molecule(예: DNA, RNA, 단백질 등)은 일부 molecule의 integrity가 다른 molecule 보다 더 취약하기 때문에 어떤 lysing beads가 적절한지 결정해야 합니다.

효과적으로 샘플을 lysis 및 homogenization 하기 위해서는 샘플 질량, 용기 부피 및 lysing matrix 사이의 균형을 찾는 것이 중요합니다. 일반적으로 샘플은 용기 부피의 1/3을 초과해서는 안 되며 lysing matrix는 1/3을 초과하지 않아야 합니다.

MP Bio에서는 샘플에 적합한 lysing matrix를 쉽게 선택할 수 있으며, 2mL ~ 50mL 범위의 바로 사용할 수 있는 lysing matrix tube와 96-well racks을 공급하고 있습니다. FastPrep® Lysing Matrix tubes 는 낮은 충격에서 높은 충격까지 다양한 제품이 구비되어 있어 세포벽이 딱딱하거나 부드럽거나 상관없이 모든 샘플 유형을 파쇄할 수 있습니다.

Bead Beating Systems

성공적인 lysis 및 homogenization을 위해 샘플은 lysing matrix로 강력하게 agitation 되어야 합니다. 소용돌이 방식의 움직임을 가진 vortex의 경우 미생물을 파쇄하는 데 사용할 수는 있지만 bead beating 장비에 비해 효율이 떨어지고 조직의 homogenization에는 효과가 없습니다. 다양한 샘플 유형을 처리하는 실험실의 경우 튜브를 진동시키는 bead beating devices 를 사용하는 것이 이상적이며, 이를 통해 더 나은 grinding 및 mechanical tissue homogenization이 가능합니다.

FastPrep96과 같은 high throughput homogenizer의 경우 lysing matrix의 운동 에너지를 샘플에 집중시키는 linear motion을 사용하며, 다른 형태의 튜브 뿐만 아니라 deep well plate 에서도 샘플을 처리할 수 있습니다.

특수 응용분야를 위한 Bead Beating

단단한 씨앗, 뼈, 암석 또는 나무와 같은 특히 저항성이 강한 샘플은 효과적인 grinding, lysing, homogenization을 위해 보다 공격적인 bead beating이 필요하며, 샘플의 integrity를 유지하고 오염을 방지하기 위해 특정 파쇄 조건이 필요할 수 있습니다.

특수 응용분야의 파쇄 예로는 매우 단단하거나 파쇄가 어려운 샘플의 dry grinding이 있는데, 이는 열을 발생시켜 플라스틱 튜브에 손상을 줄 수 있습니다. 또한 극저온의 온도에서 cryogenic homogenization 도 플라스틱 튜브의 손상을 야기할 수 있습니다. 비생물학적 샘플(non-biological sample) 또는 플라스틱 오염이 우려되는 법의학 샘플( forensics ), 플라스틱 재질과 호환되지 않는 유기용매 또는 화학물질 사용 등도 해당됩니다. 이런 유형의 응용분야의 경우 MP Bio 사의 FastPrep-24^TM 장비와 같은 특화된 bead beater/ homogenizer와 stainless steel bead beating tubes를 함께 사용하는 것이 이상적입니다.

요약

Bead beating은 생명과학 연구에 있어 식물, 미생물, 인체 조직과 같은 생물학적 샘플을 물리적으로 파쇄시키는 효과적인 접근법입니다. Lysing matrix의 크기, 모양, 재질 및 구성에 따라 작용 방식이 결정되기 때문에 적절한 lysing matrix 및 lysing beads를 선택하기 위해서는 샘플 타입, 원하는 파쇄 결과 및 target molecule(예: DNA, RNA 또는 단백질)등을 고려해야 합니다. MP Biomedicals에서는 모든 샘플 타입에 대한 bead beating 자료 및 솔루션을 찾을 수 있습니다.